PCR-Methode: Ablauf, Primer und Taq-Polymerase

PCR steht für Polymerase-Kettenreaktion. Die PCR-Methode kopiert einen ausgewählten Abschnitt der DNA in vielen Wiederholungen, bis aus wenigen Molekülen Milliarden Kopien geworden sind. Sie wurde in den 1980er Jahren von Kary Mullis entwickelt, der dafür 1993 den Nobelpreis für Chemie erhielt. Heute gehört sie zu den wichtigsten Verfahren der Molekularbiologie.

Das Prinzip ähnelt der DNA-Replikation in der Zelle, nur im Reagenzglas. Dort trennt ein Enzym die beiden Stränge, und ein anderes baut an jedem Einzelstrang einen neuen Gegenstrang auf. Bei der PCR wird dasselbe mit Temperaturänderungen erreicht. Durch Erhitzen trennen sich die Stränge, beim Abkühlen lagern sich Startstücke an, und ein Enzym baut den Strang auf.

Wichtig ist, dass die PCR gezielt arbeitet. Sie vervielfältigt nicht das gesamte Erbgut, sondern nur den Abschnitt zwischen zwei Startstücken, den Primern. So kann man aus einer winzigen Probe, etwa aus einer einzigen Haarwurzel, genug DNA für eine Untersuchung gewinnen.

Für die PCR werden fünf Bestandteile gebraucht. Erstens die Matrizen-DNA, also die Probe mit dem Abschnitt, der kopiert werden soll. Zweitens zwei Primer. Das sind kurze, einzelsträngige DNA-Stücke, die an den Anfang und an das Ende des Zielabschnitts passen. Sie legen fest, welcher Bereich vervielfältigt wird, und liefern der Polymerase einen Startpunkt.

Drittens braucht man die Taq-Polymerase. Dieses Enzym baut aus Nukleotiden neue DNA-Stränge auf. Es stammt aus dem Bakterium Thermus aquaticus, das in heißen Quellen lebt, und ist deshalb hitzestabil. Das ist entscheidend, denn bei jedem Zyklus wird die Mischung auf etwa 95 Grad Celsius erhitzt. Ein normales Enzym würde dabei zerstört. Das hitzestabile Enzym übersteht alle Zyklen.

Viertens werden Nukleotide benötigt, die Bausteine der neuen DNA, nämlich die vier Basen A, T, G und C. Fünftens sorgt eine Pufferlösung für passende Bedingungen. Alles wird in einem kleinen Reaktionsgefäß gemischt und in ein Gerät gestellt, das die Temperatur automatisch ändert, den Thermocycler.

Ein Zyklus der PCR-Methode besteht aus drei Schritten. Im ersten Schritt, der Denaturierung, wird die Probe auf etwa 95 Grad Celsius erhitzt. Dabei brechen die Wasserstoffbrücken zwischen den Basen, und der Doppelstrang trennt sich in zwei Einzelstränge.

Im zweiten Schritt, der Anlagerung, wird die Temperatur auf etwa 50 bis 65 Grad Celsius gesenkt. Jetzt lagern sich die Primer an die passenden Stellen der Einzelstränge an. Die genaue Temperatur hängt von der Länge und der Basenfolge der Primer ab. Im dritten Schritt, der Verlängerung, arbeitet die Taq-Polymerase bei etwa 72 Grad Celsius. Sie hängt ab dem Primer passende Nukleotide an und baut so den Gegenstrang auf.

Danach liegen aus einem Doppelstrang zwei Doppelstränge vor. Der Zyklus beginnt von vorn, meist 25 bis 35 Mal. Ein vollständiger Durchlauf dauert nur wenige Stunden. Die Grafik zeigt den Ablauf eines Zyklus in der Übersicht.

Das Besondere der PCR ist die Verdopplung in jedem Zyklus. Aus einem Molekül werden nach dem ersten Zyklus zwei, nach dem zweiten vier, nach dem dritten acht. Allgemein ergibt sich nach n Zyklen etwa die Zahl 2 hoch n. Nach 30 Zyklen sind das rund eine Milliarde Kopien. Man nennt dieses Wachstum exponentiell.

In der Praxis ist die Verdopplung nicht ganz perfekt, und gegen Ende der Reaktion lässt die Ausbeute nach, weil Zutaten verbraucht sind. Trotzdem reicht die Menge am Ende für jede weitere Analyse. Deshalb genügen für eine PCR schon winzige Spuren, und es ist wichtig, sauber zu arbeiten.

Gerade diese Empfindlichkeit ist auch eine Schwäche. Kleinste Verunreinigungen mit fremder DNA werden mitvervielfältigt und können das Ergebnis verfälschen. Labore arbeiten deshalb mit Handschuhen, getrennten Arbeitsbereichen und Kontrollproben, in denen keine DNA enthalten sein darf.

Die PCR-Methode wird in vielen Bereichen eingesetzt. Bei medizinischen Tests weist man damit Erreger nach, indem man nach deren Erbgut sucht. Der bekannte PCR-Test auf Viren nutzt dieses Prinzip, wobei bei RNA-Viren das Erbgut zuerst in DNA umgeschrieben wird. Auch Erbkrankheiten lassen sich nachweisen, indem man den betreffenden Genabschnitt vervielfältigt und untersucht.

In der Kriminalistik und bei Vaterschaftstests bildet die PCR die Grundlage des genetischen Fingerabdrucks. In der Forschung dient sie dazu, Gene für weitere Versuche herzustellen, zum Beispiel für die Gentechnik. In der Lebensmittelkontrolle prüft man, ob ein Produkt Bestandteile bestimmter Tierarten oder gentechnisch veränderter Organismen enthält.

Auch in der Evolutionsforschung ist die PCR wichtig. Aus winzigen Resten alter Knochen lässt sich DNA gewinnen und vervielfältigen, so konnten Forscher das Erbgut ausgestorbener Menschenformen untersuchen. Ohne die PCR wären viele moderne Entdeckungen nicht möglich gewesen.

Ein häufiger Fehler ist, PCR und DNA-Replikation in der Zelle gleichzusetzen. Das Prinzip ähnelt sich, aber die Abläufe unterscheiden sich. In der Zelle trennt ein Enzym, die Helikase, die Stränge, bei der PCR geschieht das durch Hitze. In der Zelle wird das ganze Erbgut kopiert, bei der PCR nur der Abschnitt zwischen den Primern.

Ein zweiter Fehler betrifft die Taq-Polymerase. Sie ist nicht deshalb besonders, weil sie schneller wäre, sondern weil sie hitzestabil ist. Würde man eine normale Polymerase verwenden, müsste man sie nach jedem Erhitzen neu zugeben. Mit der Taq-Polymerase kann man alle Zyklen automatisch hintereinander ablaufen lassen.

Der dritte Fehler: Man glaubt, die PCR erzeuge ein Bild der DNA oder lese die Basenfolge. Sie erzeugt nur Kopien. Um die Kopien zu untersuchen, braucht man weitere Verfahren wie die Gelelektrophorese oder die DNA-Sequenzierung.

Die PCR-Methode ist dir wahrscheinlich schon im Alltag begegnet. Bei Virusinfektionen wie COVID-19 waren PCR-Tests im Einsatz, bei denen Proben aus Nase oder Rachen im Labor untersucht wurden. Ihr Vorteil ist die hohe Empfindlichkeit: Schon sehr kleine Mengen Erbgut des Erregers reichen für einen Nachweis.

Auch in Krimis spielt die Methode eine Rolle, wenn DNA-Spuren am Tatort untersucht werden. Aus einem winzigen Speichelrest oder einer Haarwurzel entsteht mit der PCR genug Material für ein DNA-Profil. Das erklärt, warum heute auch sehr kleine Spuren Fälle klären können.

Selbst bei der Lebensmittelkontrolle wird die PCR eingesetzt, etwa um Fleischprodukte auf ihre Tierart zu prüfen oder Allergene nachzuweisen. Die Methode ist damit weniger geheimnisvoll, als sie klingt: Sie ist ein Kopiergerät für DNA, das auf Temperaturschritten beruht.